Sintesi peptidica non ribosomiale: il caso di Gramicidina S

Gli amminoacidi in natura possono trovarsi in configurazione stereochimica sia D che L. Nelle proteine tuttavia, salvo qualche rara eccezione, si trovano solo amminoacidi della serie L. Il motivo è che le proteine devono riconoscere specifici substrati, spesso aventi una stereochimica, dunque non ci si può permettere di usare amminoacidi a caso. Questo non significa che tutti gli amminoacidi naturali devono essere L né che tutti gli amminoacidi presenti nei peptidi siano L. Gramicidina S è un classico esempio di peptide in cui la struttura primaria presenta amminoacidi sia della serie D che della serie L. La sintesi di un peptide costituito da amminoacidi sia D sia L è possibile grazie ad un macchinario enzimatico alternativo ai ribosomi. In questo post verrà argomentato il meccanismo molecolare che porta alla sintesi di Gramicidina S.

I peptidi e le proteine sintetizzate a livello ribosomiale sono costituiti solo da amminoacidi L. Esistono poi dei peptidi la cui sintesi non è ribosomiale e che possono presentare amminoacidi D nella loro sequenza. Un esempio è rappresentato dai peptidi ciclici, aventi spesso una funzione biologica importante per la stessa cellula che li produce, generalmente batterica. Questi peptidi hanno spesso funzioni difensive nei confronti di altri organismi. I peptidi ciclici non hanno, ovviamente, le estremità N- e C-terminali libere, ma formano tra loro un legame peptidico responsabile della ciclizzazione del peptide. Se un peptide ciclico viene fatto con amminoacidi idrofobici, avrà sì una certa idrofilia data dai legami ammidici, ma sarà sostanzialmente lipofilo grazie alla presenza di catene laterali apolari che si affacciano al di fuori del canale costituito dal ciclopeptide. Date le caratteristiche lipofile di questo peptide, esso potrà interagire coi fosfolipidi di membrana ed attraversare la membrana stessa, restandoci immerso.

L’impilamento di più ciclopeptidi nello spessore della membrana plasmatica porta alla formazione di canali ionici. L’antibiotico Gramicidina S è uno ionoforo a canale formato da un peptide di 10 residui, caratterizzato dalla presenza di residui L e D e prodotto da Bacillus brevis. Nel complesso forma un canale che permette il passaggio di ioni, alterando di fatto l’equilibrio sodio/potassio della cellula aggredita e provocandone la morte.

Gramicidina S presenta 5 amminoacidi ripetuti testa-coda; partendo da una (D)Phe e procedendo in senso antiorario troviamo: (D)Phe-Pro-Val-Orn-Leu-(D)Phe-Pro-Val-Orn-Leu. Notiamo la presenza di due D-Phe e due Ornitine, che non sono amminoacidi proteinogenici.

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Struttura del peptide Gramicidina S, da Wikimedia Commons (Autore: Danielchemik)

Per sintetizzare questa molecola ci sono due enzimi che lavorano in tandem: il Light enzyme (LE) e l’Heavy Enzyme (HE). Questi enzimi sono pieni di amminoacidi Cisteina. Per prima cosa il LE esegue un attacco nucleofilo (con un tiolo di una cisteina) su una L-Phe adenilata (in sostanza una L-Phe attivata con ATP a formare un’anidride mista): per sostituzione nucleofila acilica si ottiene il tioestere della Phe ancorata al LE più AMP.

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Contemporaneamente a ciò, l’enzima fa anche un’altra cosa: si comporta da deidrogenasi/idrogenasi, invertendo la stereochimica della Fenilalanina da L a D (o da S a R secondo la notazione RS).

Fenilalanina-isomeria

Fenilalanina nelle due forme chirali

Nello stadio successivo si avvicina HE, il quale ha fatto un’operazione analoga con una Pro, agganciata con un legame tioestereo. La Pro presenta un amminogruppo secondario, che è un po’ più basico di un’ammina primaria. L’amminogruppo secondario della Pro è un nucleofilo che, quando l’HE si avvicina al LE, vede il tioestere e fa una trans-tioamido esterificazione, formando un’ammide, che è molto più stabile di un tioestere, e facendo uscire LE. Questa è una reazione spontanea: i due enzimi operano in tandem per formare un legame peptidico. Il dipeptide Fenilalanilprolina rimane legato su HE.

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A questo punto tutto continua sull’Heavy Enzyme. Un altro –SH va a legare una Val tramite legame tioestereo. Il pH locale del HE è tale per cui l’NH2 della Val non sia protonato e la distanza col dipeptide Phe-Pro è tale per cui può avvenire una sostituzione nucleofila acilica con formazione del tripeptide (D)Phe-Pro-Val.

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Il tripeptide passa a questo punto ad un braccio di fosfopanteteina ancorato per fosfoesterificazione ad una Serina del HE. Il derivato fosforilato dell’acido pantotenico (vitamina B5) è dato dalla fusione, tramite legame carboamidico, di una molecola di β-alanina con una molecola di acido pantoico. L’acido pantotenico ammidificato con la β-mercaptoetilammina dà la fosfopanteteina.

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Struttura della fosfopanteteina, da Wikimedia Commons

Dopo aver sintetizzato il tripeptide, la fosfopanteteina, vicina al tripeptide tioesterificato, effettua una trans-tioesterificazione prendendosi il tripeptide. Sul gruppo SH adesso libero viene attaccato a questo punto l’amminoacido Ornitina. Si forma anche in questo caso un legame tioestereo. L’NH2 libero dell’amminoacido Orn a sua volta fa una trans-tioamido esterificazione, formando il tetrapeptide (D)Phe-Pro-Val-Orn, il quale per trans-tioesterificazione passa nuovamente al braccio pantotenico.

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A questo punto sul tiolo libero si ancora una Leucina, la quale poi usa il gruppo amminico per fare una trans-tioamido esterificazione sul tioestere del tetrapeptide. Si arriva alla formazione del pentapeptide (D)Phe-Pro-Val-Orn-Leu, che resta attaccato alla Cys mediante legame tioestere. Infine, il braccio pantotenico usa il suo SH libero per fare una trans-tioesterificazione, prendendosi il pentapeptide.

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Da un’altra parte dell’HE è stata fatta la stessa sintesi di questo pentapeptide. I due pentapeptidi vengono quindi posizionati testa-coda. La distanza tra i tioesteri e gli NH2 è tale per cui i gruppi amminici terminali vanno a fare una doppia trans-tioamidoesterificazione formando il decapeptide ciclico finale.

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Descrizione e fonte immagine: Struttura del peptide Gramicidina S, da Wikimedia Commons

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