Il direttore d’orchestra dell’immunità

In occasione dell’edizione N.26 del Carnevale della Chimica, dedicato alla  “chimica della difesa” ed ospitato sul blog di Teresa Celestino “Pensieri in provetta”, ho deciso di partecipare realizzando un post sul sistema del complemento. Buona lettura.

 

Parigi, 1890. Presso l’Istituto Pasteur, il medico e microbiologo Jules Bordet scopre per la prima volta l’esistenza di una “sostanza” termolabile contenuta nel siero, in grado di completare il piano di difesa dell’ospite esercitato dagli anticorpi, proteine resistenti al trattamento termico: il sistema del complemento, ossia il principale effettore della parte umorale del sistema immunitario. Bordet dimostra che un antisiero di pecora perde il suo effetto batteriolitico nei confronti di Vibrio cholerae se viene prima sottoposto a riscaldamento, mentre riacquista l’effetto se ad esso viene aggiunto siero fresco privo di anticorpi. In questo modo Bordet ipotizza che affinché si esprima l’attività batteriolitica non solo sono necessari gli anticorpi specifici per il batterio, ma anche un complesso insieme di fattori termolabili che coronano l’azione immunitaria.

Il lavoro di Bordet ha aperto la strada verso la definizione dei meccanismi di difesa propri del sistema del complemento, tant’è vero che poco dopo la sua scoperta è stato dimostrato che, oltre alla lisi indotta dagli anticorpi, il sistema del complemento opera anche durante la risposta immunitaria innata. In questo caso determinate molecole normalmente presenti nel siero, chiamate proteine di fase acuta, hanno la capacità di attivare il sistema del complemento, che media la distruzione dei patogeni avendone prima riconosciuto delle “etichette molecolari”, chiamate PAMP (spettri molecolari associati ai patogeni) che ne certificano l’estraneità dall’ospite.

Il sistema del complemento, già da queste prime battute, si presenta come un attore polivalente deputato alla difesa dell’organismo dagli agenti patogeni, nell’ambito sia di una risposta immunitaria specifica che di natura aspecifica o innata. In questo post descriverò i componenti del sistema del complemento, le vie di attivazione ed i principali effetti biologici che ne derivano.

Oggi sappiamo che il sistema del complemento è un direttore d’orchestra molto antico dei processi immunitari ed infiammatori, composto da almeno 30 proteine solubili e di membrana. Proteine che, per mezzo di confronti strutturali, sono state individuate anche negli Invertebrati, organismi meno complessi che possiedono un sistema immunitario primitivo di tipo esclusivamente aspecifico. Nei Vertebrati, invece, il complemento è un sistema più sofisticato che stabilisce una connessione tra i due tipi di immunità (innata e acquisita) e la cui attività non si limita alla lisi cellulare, ma si esplica in vari modi: lisi di virus, batteri e cellule attraverso vie che possono anche non dipendere dagli anticorpi; fagocitosi di antigeni o interi microrganismi per opsonizzazione; attivazione della risposta infiammatoria; deposito di immunocomplessi nella milza e nel fegato.

Le proteine del sistema del complemento costituiscono circa il 5% in peso delle globuline sieriche e le maggior parte è per lo più presente come precursore inattivo (zimogeno) fino a che una proteasi effettua la scissione in due frammenti di dimensioni molto diverse. Il frammento più grosso o maggiore (indicato sempre con la lettera “b”, ad eccezione del C2b, che rappresenta il peptide minore) si lega al bersaglio mediante il sito attivo, disponibile all’interazione solo dopo la scissione proteolitica; il frammento più piccolo (indicato sempre con la lettera “a”, ad eccezione di C2a, che rappresenta il frammento maggiore), o inibitorio (poiché era quello che impediva al primo frammento di interagire col target), si lega a recettori specifici che promuovono l’infiammazione. I frammenti maggiori del complemento esprimono l’attività immunitaria solo dopo aver interagito tra loro formando complessi. Le sorgenti di derivazione delle proteine del complemento sono principalmente gli epatociti, ma sono sede di sintesi anche cellule dell’epitelio gastrointestinale e genitourinario, macrofagi tessutali e monociti.

L’attivazione del complemento procede attraverso tre possibili percorsi (la via classica, alternativa e lectinica), che confluiscono nella parte finale, ossia nella formazione del complesso di attacco alla membrana (MAC).

La via classica inizia con il legame dell’antigene o del batterio con l’anticorpo, che può essere IgM o IgG. L’interazione con l’antigene induce nell’anticorpo una modificazione conformazionale (si dice che le IgM pentameriche assumono una configurazione “a pinza”) che espone un sito di legame della porzione Fc degli anticorpi per la componente C1 del sistema del complemento. C1 è un complesso macromolecolare costituito da una molecola di C1q che interagisce con due molecole di C1r e due di C1s. C1q è formato da 18 catene polipeptidiche organizzate in sei triple eliche, dove ciascuna tripla elica è strutturalmente simile al collagene e forma ad una estremità una testa che interagisce con il dominio CH2, localizzato in corrispondenza della porzione Fc dell’anticorpo. Ogni monomero C1r e C1s presenta due domini: uno catalitico e uno di legame con C1q e tra loro stessi. Affinché l’interazione C1-anticorpo sia stabile, è necessario che il complesso C1 si leghi, per mezzo delle teste di C1q, a minimo due regioni Fc.

C1protein

Componente C1 (Fonte: wikidoc.org)

 

L’interazione di C1q con i frammenti Fc determina l’attivazione dei due monomeri C1r, i quali agiscono da serin proteasi nei confronti dei due monomeri C1s che, a loro volta, sono proteasi a serina aventi come substrati C4 e C2. C4 è una glicoproteina costituita da tre catene polipeptidiche, chiamate α, β e γ. I monomeri C1s digeriscono C4 generando un corto segmento amminoterminale della catena α, chiamato C4a, e un frammento più grande, chiamato C4b. Quest’ultimo espone un sito di legame per C1 e per C2 proenzimatico. Il C2, trovandosi vicino a C1, subisce l’attività proteasica di C1s e dà origine nuovamente a due frammenti di dimensioni differenti. Il frammento più grande, ossia il C2a, costituisce con C4b un complesso C4b2a, denominato C3 convertasi, in quanto capace di attivare il proenzima C3.

Una singola molecola di C3 convertasi amplifica la cascata del sistema complementare in quanto è in grado di scindere per idrolisi, dunque attivare, numerose molecole di C3 in C3a e C3b. Quest’ultimo ha il compito di legare la C3 convertasi in modo tale da permetterle di riconoscere e attivare, sempre mediante attività proteasica, il C5 in C5a e C5b, il quale (C5b) si lega al C6 ponendo così le basi verso la formazione del complesso di attacco alla membrana (MAC). Bisogna comunque precisare che una frazione di molecole C3b, generate dall’attività catalitica della C3 convertasi, vengono utilizzate per promuovere la fagocitosi di immunocomplessi e di antigeni corpuscolati (batteri, virus, globuli rossi). L’attività biologica di C3b è possibile solo grazie alla presenza di un gruppo tioestere intramolecolare (reso instabile dal clivaggio), che permette a questa proteina di legarsi a gruppi idrossilici o amminici liberi di C5 o dei recettori sulla membrana dei fagociti.

La via alternativa è indipendente dagli anticorpi e fa parte del sistema immunitario innato. Essa è attivata in genere da microrganismi, cellule tumorali o globuli rossi eterologhi che portano antigeni di superficie estranei all’ospite (per esempio, lipopolisaccaridi nei batteri Gram-negativi) e coinvolge quattro proteine sieriche: C3, fattore B, fattore D e properdina. Nella via alternativa il C3 idrolizza spontaneamente formando C3b, che si lega agli antigeni non-self di superficie. In realtà C3b si lega pure alle cellule dell’ospite, ma viene subito inattivato dall’acido sialico presente ad alti livelli sulla membrana delle cellule. Le superfici dei patogeni presentano invece basse quantità di acido sialico, pertanto il C3b che si lega agli antigeni è in grado di restare attivo e legarsi al fattore B, instaurando un complesso stabilizzato da ioni magnesio. L’interazione tra C3b e fattore B fa sì che quest’ultimo esponga un sito su cui agisce il fattore D, una proteasi che idrolizza il fattore B generando un complesso C3bBb che ha attività C3 convertasica, ed è quindi funzionalmente analogo al complesso C4b2a della via classica. Il legame con la properdina stabilizza la C3 convertasi che da sola avrebbe bassa emivita. L’attivazione della C3 convertasi ha lo scopo di amplificare, con un meccanismo a feedback positivo, la quantità di C3b che serve per formare il complesso C3bBb3b, il quale agisce da C5 convertasi ed è perciò analogo al complesso C4b2a3b della via classica. Dall’idrolisi di C5 si libera C5a che diffonde via e C5b che si lega all’antigene, dando così inizio alla fase litica conclusiva.

La via lectinica, al pari di quella alternativa, non richiede l’intervento degli anticorpi per essere attivata. L’innesco di questa via dipende invece dal riconoscimento e dal legame di specifiche lectine (proteine) del siero con residui di mannosio (un monosaccaride) presenti in glicoproteine o carboidrati sulla superficie esterna dei microrganismi patogeni (per esempio, Candida albicans e virus come HIV-1). Anche le cellule di mammifero, come l’uomo, sono potenziali attivatori della via lectinica, in quanto espongono residui di mannosio sulla membrana cellulare, tuttavia la nutrita presenza anche in questo caso di acido sialico impedisce alla lectina di innescare impropriamente il sistema del complemento.

Le lectine coinvolte in questa via sono proteine di fase acuta, le cui concentrazioni sieriche aumentano nel corso di una risposta infiammatoria. Dal punto di vista strutturale e funzionale, le lectine leganti il mannosio (MBL) sono simili al C1q della via classica. La MBL si lega da un lato alla superficie dell’agente estraneo (direttamente, senza l’ausilio degli anticorpi, come invece accade per C1q) e dall’altro a due proteasi a serina associate a MBL (MASP-1 e MASP-2) simili per struttura e funzione ai monomeri C1r e C1s. Il complesso venutosi a formare ha attività C1-simile ed infatti provoca una cascata enzimatica che comprende l’attivazione di C2 e C4, la generazione prima di C3 convertasi e poi di C5 convertasi, come già discusso per la via classica. La differenza principale con la via classica è che la via lectinica attiva il medesimo sistema complementare, escluso C1, senza la mediazione degli anticorpi, rappresentando perciò, unitamente alla via alternativa, un’importante meccanismo di risposta immunitaria innata.

MEDIUM_281_2007_90_Fig1_HTML

Vie di attivazione del sistema del complemento (Fonte: springerimages.com)

 

Le tre vie di attivazione del complemento convergono nella fase di amplificazione di C3b e nella generazione della C5 convertasi, dalla cui attività origina una cascata di eventi molecolari che culmina nella formazione del complesso di attacco alla membrana (MAC), un canale attraverso il quale, a causa della libera diffusione di ioni e piccole molecole, si assiste alla perdita dell’equilibrio osmotico e la morte per lisi. La genesi del canale è frutto di interazioni sequenziali che coinvolgono diverse proteine del complemento. Tutto comincia a partire dalla forma attiva di C5, C5b, che lega C6. Il complesso C5b6, legandosi a C7, va incontro ad una modificazione conformazionale che espone porzioni idrofobiche che gli permettono di interagire coi fosfolipidi di membrana e di penetrare all’interno del bilayer fosfolipidico. Il successivo legame di C8 al complesso C5b67 comporta la formazione di un poro sufficientemente ampio (10 Å) da provocare la lisi di un eritrocita, ma non di una cellula nucleata. L’ultimo step per la formazione di un MAC completo coinvolge fino a circa 17 molecole di C9 che circondano un singolo complesso C5b678, dando luogo ad un poro di diametro maggiore (80 Å) in grado di lisare e distruggere i microrganismi invasori, inclusi quasi tutti i virus con envelope (tra i quali herpes virus, ortomixovirus, paramixovirus e retrovirus), e le cellule nucleate, come quelle tumorali. Tuttavia sono stati osservati, soprattutto nelle cellule tumorali, fenomeni di endocitosi del MAC che permettono a tali cellule di eludere la morte per lisi indotta dall’attivazione del complemento per mezzo di anticorpi, vanificando in questo modo la possibilità di utilizzare il sistema del complemento come macchinario di difesa dal cancro.

classical-complement

Via di attivazione classica del sistema complementare (Fonte: www.virology.ws)

 

Le vie di attivazione del complemento sono finemente regolate, in modo tale da assicurare che l’attività complementare sia il più possibile indirizzata solo verso i veri bersagli, i patogeni. Il sistema del complemento si avvale di meccanismi di regolazione passiva, come il tempo di emivita piuttosto ristretto di alcuni componenti, o di regolazione più stringente, mediata da una famiglia di proteine RCA (regulators of complement activation) che agiscono nelle diverse fasi della cascata complementare: prima dell’assemblaggio della C3 convertasi; dopo la formazione della C3 convertasi; durante la formazione del MAC. Le proteine regolatrici dell’attivazione del complemento determinano la dissociazione dei complessi (un esempio è C1inh, che provoca la dissociazione dei monomeri C1r e C1s da C1q), oppure impediscono l’associazione (ad esempio, la formazione della C3 convertasi nella via classica o lectinica è bloccata da diverse proteine che si oppongono all’associazione tra C4b e C2a) o ne prevengono l’attività (ad esempio la proteina S causa nel complesso C5b67 una modificazione conformazionale che impedisce al complesso di inserirsi nella membrana).

Come ho anticipato all’inizio di questo post, ai prodotti del complemento non si attribuisce soltanto la lisi cellulare, ma ad essi si possono associare molteplici effetti biologici. Per esempio, C3a, C4a e C5a, i frammenti più piccoli che derivano dalla idrolisi rispettivamente di C3, C4 e C5, sono peptidi chemotattici, noti come anafilotossine, che inducono il rilascio di istamina e di altri mediatori chimici dell’infiammazione dai mastociti e dai granulociti basofili. Le anafilotossine, inoltre, mediano la contrazione dei muscoli lisci ed aumentano la permeabilità dei vasi sanguigni, favorendo la migrazione di anticorpi e leucociti dal circolo ematico nelle sedi dell’infiammazione. Non solo. Studi recenti dimostrano che alcuni fattori del complemento, in particolare le anafilotossine, sono in grado di stimolare nei macrofagi e nelle cellule dendritiche la produzione di citochine proinfiammatorie normalmente indotte  dall’attivazione di un gruppo di recettori di tipo Toll (TLR), importanti recettori dell’immunità innata. Contemporaneamente, si è visto anche che l’attivazione degli stessi TLR segnala alle cellule di potenziare l’espressione dei componenti del complemento e/o dei loro recettori. Messo in evidenza il cross-talk tra i TLR ed i fattori del complemento, le ricerche adesso mirano a dimostrare la co-associazione e l’eventuale interdipendenza tra i recettori del complemento e dei TLR, nei fagociti.

C3b e C4b sono opsonine che, nel corso di una risposta immunitaria, si depositano sugli immunocomplessi o sugli antigeni corpuscolati fino a ricoprirli, con l’obbiettivo di neutralizzarli e favorire l’ingestione da parte dei fagociti. L’ingestione dell’antigene è potenziata dalle anafilotossine come C5a, che induce nei fagociti l’espressione dei recettori per i componenti del complemento ad attività opsonizzante. La fagocitosi per opsonizzazione è un meccanismo di difesa particolarmente prezioso, sebbene non sempre efficace, nei casi di infezione da batteri Gram positivi, come Streptococcus pneumoniae, il quale è naturalmente resistente alla lisi attivata dal complemento grazie alla capsula ed allo spesso strato di peptidoglicano che costituisce la sua parete cellulare e che impedisce la formazione del MAC.

I globuli rossi sono i principali effettori della rimozione degli immunocomplessi circolanti. Gli eritrociti, infatti, al pari dei leucociti, esprimono i recettori, chiamati CR1, per C3b (la proteina del complemento che riveste gli immunocomplessi solubili) ma, essendo molto più numerosi rispetto ai globuli bianchi, risultano essere i principali trasportatori di immunocomplessi nel sangue. I globuli rossi legano e veicolano gli immunocomplessi nel fegato e nella milza, dove li cedono ai macrofagi. Alterazioni di questo processo, in particolare il deficit di C1, C2, C4 e CR1, provocano un accumulo di immunocomplessi, causa di danni tessutali soprattutto a livello dei reni e della cute. La carenza dei suddetti fattori del complemento (specialmente C4) o del recettore CR1 può predisporre al lupus eritematoso sistemico (LES), una malattia cronica di tipo auto-immune.

Quando infatti il sistema del complemento non funziona, in genere perché il soggetto presenta deficit congeniti dei componenti del complemento o delle proteine regolatrici, aumenta significativamente il rischio di infezioni ricorrenti e/o di malattie da immunocomplessi (glomerulonefrite, LES, vasculiti).

Le vie di attivazione del complemento non sono solo tre, me esiste una quarta e forse anche una quinta via. Negli ultimi tempi la ricerca sul sistema del complemento ha partorito nuove ipotetiche vie di attivazione. Una di queste rappresenta la ciliegina sulla torta dopo tutti gli studi volti a dimostrare che esistono molteplici cross-talk tra i due principali sistemi a base di proteasi a serina dell’organismo umano: la cascata del complemento, appunto, e la coagulazione. Alcuni studi hanno infatti messo in evidenza che la trombina, potente serina proteasi necessaria per l’attivazione del fibrinogeno, opera direttamente l’idrolisi di C3 e C5. Il C5a, formatosi in seguito all’attività proteasica della trombina, avrebbe la duplice funzione di favorire il processo coagulativo e di inibire la fibrinolisi, con lo scopo di creare dei coaguli locali che impediscono ai microrganismi patogeni di propagarsi attraverso il sistema circolatorio.

Altri studi hanno inoltre dimostrato che l’attivazione del complemento non è solo una questione umorale o di interplay con i fattori di coagulazione del sangue: a quanto pare esiste la possibilità che siano direttamente le cellule, nello specifico i fagociti (sia essi macrofagi che granulociti), a catalizzare, per mezzo di un gruppo di proteasi a serina legate alla loro membrana plasmatica, il taglio del componente C5, con le conseguenze biologiche di cui ho discusso.

Chi desidera approfondire ulteriormente può comunque farlo da qui, qui, e qui.

Grazie e a presto!

 

Immagine: Ritratto di Jules Bordet, Paul Delvaux. Fonte immagine: byricardomarcenaroi.blogspot.com)

You Might Also Like

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *