Elettroforesi bidimensionale di proteine

L’elettroforesi su gel in due dimensioni (2-DE) è il punto di partenza per fare studi di proteomica. Per proteomica di un tessuto o di un tipo cellulare si intende il profilo completo delle proteine, incluse le isoforme, le varianti patologiche e le varianti con modifiche post-traduzionali, del tessuto o della cellula in una determinata fase di sviluppo o in risposa a stimoli esterni.

In seguito al completamento di numerosi progetti genomici, si è assistito alla nascita e all’evoluzione di banche dati derivanti da vari progetti di proteomica. Un esempio di banca dati proteomica è Swiss-2DPAGE, fondata nel 1993 e gestita dal Biomedical Proteomics Research Group (BPRG) e dal Proteome Informatics Group del SIB (Swiss Institute of Bioinformatics). Swiss-2DPAGE raccoglie mappe derivanti da esperimenti di elettroforesi su gel bidimensionale e informazioni relative alle proteine identificate su tali mappe, quali il punto isoelettrico, il peso molecolare, la composizione amminoacidica, la funzione fisiologica, le patologie correlate e referenze bibliografiche.

Ma cos’è l’elettroforesi bidimensionale? Questo tipo di elettroforesi su gel (in genere di poliacrilammide) consiste di due passaggi: la miscela proteica che si vuole separare viene sottoposta ad una prima corsa elettroforetica e poi ad una seconda corsa in cui il campo elettrico applicato è posizionato ortogonalmente rispetto al primo.

La prima separazione avviene secondo il processo di isoelettrofocalizzazione. Sul gel viene applicato un gradiente di pH ed una differenza di potenziale, in modo tale che le proteine si separino solo in base al loro punto isoelettrico (PI): le proteine cessano di migrare quando raggiungono ciascuno la zona del gel dove il pH è tale per cui la carica netta della proteina in quella zona è nulla (il punto isoelettrico), cioè la proteina si trova nella sua forma zwitterionica. Proteine diverse possono avere lo stesso PI e quindi localizzarsi a livello della stessa banda, motivo per cui occorre procedere con un’ulteriore separazione, non più basata sulle proprietà elettriche delle molecole.

Nel secondo step, infatti, si procede con una separazione che dipende solo dalla massa e non più dalla carica netta. Le proteine vengono perciò trattate con SDS (Sodio DodecilSolfato), un anione organico che lega e denatura la proteina, conferendole carica netta negativa. Ciascuna proteina, unfoldata, lega tante molecole di SDS in proporzione al proprio peso molecolare. In altre parole, proteine denaturate costituite da più amminoacidi legheranno più molecole di SDS di quanto facciano proteine denaturate formate da un minor numero di amminoacidi.

Poiché, come detto, una molecola di SDS reca una carica negativa, ne risulta che tutte le proteine avranno adesso all’incirca lo stesso rapporto massa/carica. Pertanto, applicando una differenza di potenziale a 90° rispetto alla prima corsa, esse potranno dare luogo ad un nuovo processo di migrazione su gel, nel quale migreranno grazie al fatto di essere cariche (negativamente) e daranno luogo a separazione basata esclusivamente sulla differenza di massa. Le proteine verranno attratte tutte verso il polo positivo del gel con una mobilità proporzionale al rapporto massa/carica che, tuttavia, è lo stesso per tutte le proteine (a massa grande corrisponde in proporzione quantità di carica elevata; a massa piccola corrisponde in proporzione quantità di carica bassa). A fare la differenza nella mobilità elettroforetica delle proteine sono le forze di attrito, col gel che funge da “setaccio molecolare” che separa le molecole solo sulla base del peso molecolare: proteine più grosse subiranno maggiore attrito e migreranno più lentamente verso il lato positivo rispetto alle proteine più piccole, che riusciranno a passare più facilmente attraverso le maglie del gel e quindi, migreranno più velocemente.

Alla fine della corsa ciò che osserviamo nel gel (con l’ausilio di coloranti, come il Coomassie Brilliant Blue) è un insieme di “chiazze”, o “spot”; ad ogni spot corrisponde presumibilmente un solo tipo di proteina.

proiso8Fonte schema: Bio-Siva

Come facciamo a dare un’identità alla proteina presente in ciascuno spot? Dal gel si ritaglia uno spot e lo si digerisce con tripsina. La tripsina è una proteasi specifica che catalizza il taglio proteolitico del legame peptidico in cui il carbonile del legame peptidico è di una arginina oppure di una lisina. Pertanto, tutti i frammenti peptidici che si formeranno a seguito della digestione della proteina avranno come primo amminoacido l’arginina o la lisina. I frammenti ottenuti dalla digestione con tripsina vengono poi analizzati con lo spettrometro di massa. In base allo spettro ottenuto, un programma assegnerà ad ogni picco un dato peso molecolare, a cui può corrispondere più di una sequenza amminoacidica. Software dedicati paragonano la digestione teorica di ogni proteina presente nelle banche dati con il dato “reale”  ottenuto dalla digestione con tripsina. Se gli spettri sono paragonabili si arriva all’identificazione, che è sempre putativa, dedotta. In realtà è difficile trovare un accordo del 100% ma se vi è corrispondenza per il 50-70%, allora l’identificazione si ritiene accettabile.

 

Descrizione e fonte immagine: Apparecchiatura per elettroforesi bidimensionale (Jean-Etienne Minh-Duy Poirrier from Bruxelles, Belgium – Ettan Daltsix with 2D gels running)

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